禾豐醫企業有限公司 林宗成經理

~前言~

流式細胞儀(Flow Cytometry)技術自1970 年代發展至今，一直為免疫學、癌症生物學等細胞分析領域中不可或缺的重要工具，具有可快速分析單細胞上所帶有的多種特性，例如:表面抗原表達多寡、細胞內之蛋白表現、DNA的含量、偵測離子通透或膜電位變化等等，以及分析不同細胞族群分布(Immune profiling)之獨特效能。

利用不同波長的光學反射鏡(optical mirrors)與帶通濾片(bandpass filters)，將待測細胞顆粒上之不同波長的螢光分子所散射之螢光訊號分別引導至個別的光學偵測器內，藉此區分不同波段之螢光物質的技術，一直是流式細胞儀的經典光學設計架構。然而，濾片式的光路設計因無法有效區隔散射波長相近的螢光分子，且受到預設之濾片規格所限制，使用者只能接受特定之螢光種類及組合，造成可同時使用的螢光數目與種類受到一定的限制；此外，為了避免相近的散射波長之螢光分子訊號互相干擾，帶通濾片可偵測的波段也因此侷限在特定範圍，導致僅能偵測部分而無法將整體之散射螢光訊號進行收集，因此也犧牲了光學偵測的靈敏度。

~全光譜分析系統技術Full Spectrum Profiling™ (FSP™)~

因受到傳統濾片式的光學偵測技術之限制導致傳統流式細胞儀一直無法有效的提升單管偵測參數的限制，為了因應現今大數據分析的研究趨勢，創新之全光譜式偵測技術突破傳統濾片式分光技術的瓶頸。

     圖一、從樣品發出的螢光訊號被收集並通過搭載於Cytek Auror儀器內的粗波分複用(CWDM) 解復用器陣列
                                                

Cytek Aurora利用專利之多通道粗波復用(CWDM)技術，將不同波長之螢光訊號展開來實現全光譜的偵測(圖一)，簡言之，此技術目前多應用於光纖通訊領域，將多種複雜的訊號整合為單一訊號便於傳輸，爾後利用解波器將整合後的訊號再次拆分開來，而此儀器就是利用專利設計之特殊解波器將受到雷射激發的螢光物質之散射光束進行拆分，把每個波段的散射光訊號都全部接收，以達到全光譜的訊號偵測之目的。因此儀器將利用所搭載的5支雷射分別激發欲偵測之螢光物質，並透過各自雷射後方的高靈敏度之雪崩光電二極體全陣列偵測模組(APD arrays)收取由解波器所拆分出來的各個波段之螢光訊號(圖二)，最後藉由軟體將五個偵測模組之光譜訊號組合成該螢光物質的特殊光譜署名(Spectral Signature)(圖三)。

圖二、Cytek Aurora 5雷射系統的光學路徑圖，待測物通過Flow cell並受到空間獨立的5支雷射分別激發，其散射光通過光纖傳至各自雷射後方的APD arrays進行偵測
　

圖三、Cytek Aurora 5 雷射系統所偵測呈現出來的特殊光譜署名(Spectral Signature)

在建構出各自螢光的特殊光譜署名後，軟體將可以使用即時光譜拆解(spectral unmixing)技術，將樣本中的混合型光譜進行分析，透過Ordinary Least Squares (OLS)最小二乘機的數學運算來分析混合型光譜中各種螢光所貢獻的比例，其中牽涉到利用大量的向量矩陣的數學公式運算。然而使用者並不需要投入精力去理解，只需要了解此技術的關鍵因子為每種特殊光譜署名(Spectral Signature)的差異程度，該技術就是透過將混合型光譜內的各種特殊光譜署名逐一拆解並計算訊號強度的占比即可得知該螢光所代表的標記表現量。

~全光譜分析系統 vs 傳統濾片式流式細胞儀~

由於該技術有別於傳統流式細胞儀只分析濾片所偵測的單一波段訊號，而是利用整體光譜署名來進行全盤的分析。其最大的差異與優勢在於:

1.可突破傳統流式細胞儀在螢光組合上的限制，透過有效區分波長相近但光譜特徵(spectrum signature)不同之螢光分子，例如APC與Alexa 647 (圖四)。此組合在傳統濾片式的機器上無法同時使用，因為兩種螢光物質的散射波長共用同一個偵測器(Detector)。

圖 四

<左上圖>:APC與Alexa647在傳統濾片式流式細胞儀因散射波段很近，因此使用同一個濾片分光，無法在同一次實驗內使用。
<左下圖>:APC與Alexa647在Cytek Aurora光譜式流式細胞儀所呈現的光譜署名差異很大，因此可以在同一次實驗內使用。
<右圖>: 利用APC與Alexa647的抗體進行偵測不同群的細胞，可以看到的確能夠有顯著的分群，代表可以在同一次實驗內使用。

2.可針對樣本本身之背景自體螢光進行偵測，套用自體螢光扣除(Autofluorescence extraction)功能，降低背景值干擾並大幅提升解析度。(圖五)，在傳統濾片式的機器上只能被動的接受自體螢光的訊號干擾，導致配色或後續分析都受到很大阻礙。

圖五、HeLa human cells were transformed with a CRISPR-Cas9 target vector carrying an mCherry reporter，可以發現利用AF extraction的功能可將實際有表達mcherry的細胞與非表達的細胞區分開來。
　

3.可大幅提升實驗效率，由於可同時偵測多種螢光參數，大幅縮減實驗耗材與抗體用量，並且減少批次誤差(Batch error)，目前已經實現單管樣本進行40色分析的高階實驗應用。(可參考OMIP-069 Forty-Color Full Spectrum Flow Cytometry Panel for Deep Immunophenotyping of Major Cell Subsets in Human Peripheral Blood.)

4.可重複使用Reference Control，在傳統濾片式的儀器中，由於使用PMT(光電倍增管)進行光電轉換，然而其穩定度與紅光區段的靈敏度不佳，因此每次進行實驗時，都需額外準備單染組樣本，對於珍貴且量少的臨床檢體的分析相當挑戰，因此Cytek Aurora搭載利用APD array的偵測器陣列，透過其高效率的光電訊號轉換以及低雜訊、高線性的特性並搭配每日進行QC (quality control)的步驟來微調APD的偵測數值，藉此讓儀器的偵測效能維持一致性，實現重複使用Reference Control的需求，大大節省珍貴樣本的浪費與染色試劑的花費。

~總結~

由於全光譜流式細胞儀能夠單管偵測多種顏色以及去除組織自體螢光的干擾，因此能夠大大彌補傳統流式細胞儀在實驗設計與後續分析上的諸多限制，其儀器內含的全光譜分析技術與軟體運算效能都是因應未來大數據與高參數分析需求相當重要的新穎技術，透過可分析多種細胞之表面抗原與自體螢光去除的功能，讓許多不同組織內的immune profile分析更加快速且精準，再搭配降維的演算法，將大量的資料進行視覺化的處理，藉此幫助高參數的細胞數據的解讀與分析。相信全光譜的分析技術將能夠幫助研究者發現更多以往所無法看到的細節，本部流式細胞核心於2022年增設一台cytek aurora光譜式流式細胞儀，搭配有uv 355 nm、405 nm、488 nm、561 nm以及640 nm五支雷射，並裝有自動上樣系統，可提供96 well盤式上樣，歡迎有需求的研究人員前來預約使用，預約相關事宜請洽流式細胞核心技術人員，分機265726。 

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