尚博生物科技股份有限公司 周家豪專員

癌症突破性療法--免疫細胞治療

2012年 Emily Whitehead為第一例接受CAR-T治療的淋巴瘤患者，奇蹟似的完全治癒，點燃了全球投入免疫細胞治療對抗癌症的熱情。2017年FDA批准第一款細胞免疫療法(Kymriah^®)，而台灣也於2018年通過特管法，至今已有許多醫院提供免疫細胞治療的服務，讓眾多癌症患者有多一份選擇與希望。此現象催生了許多新創生技公司投入此產業，目的都是開發更具療效的細胞產品，種類包含DC、NK、T cell & Car-T，而於開發階段能夠準確評估免疫細胞毒殺癌症細胞效率的分析平台便顯得至關重要了。

全球唯一的成像技術

細胞斷層掃描分析儀具有快速切層成像的能力，為全球唯一可高倍率(600倍)觀察細胞共培養的影像系統；由於傳統光學於高倍率拍攝時的對焦限制，會導致貼附性細胞準焦時，懸浮性細胞便會失焦，反之亦然；而斷層掃描成像技術可涵蓋30um範圍的Z軸，進而將其切分為96個切層，於掃描拍攝後可再進行優化與調整，因此讓高倍率拍攝細胞共培養的長時間觀測變成可能。

上圖為受弓形蟲(Toxoplasma)感染的細胞，細胞內部鵝卵石狀的聚集為蟲卵：由左圖至右圖分別為Z軸低到高的細胞切層影像，可觀察到左圖有清楚的細胞膜，切層提高時可看到細胞核，而蟲卵則是分佈在細胞內的整個立體空間。

左圖為傳統光學影像進行免疫細胞毒殺實驗的畫面，放大倍率200X便是極限了，為了定量細胞毒殺效果，通常目標細胞與免疫細胞都需要標記螢光。
右圖為NanoLive Image，可於600X清楚辨識貼附性細胞與懸浮性細胞，有了清楚的影像後，於高通量CX-A機型可拼接視野畫面拍攝更多的細胞，進一步便是產出定量的數據了！

NanoLive -- Live T Cell Assay

在獲得了突破性的高倍率影像後，進一步便是要有定量的數據；NanoLive Image的成像非真實光學影像，而是經由折射率換算而成，相比於傳統從影像擷取數據，直接從折射率擷取數據要容易的多，也會有更多的資訊。

成像分析的基礎為辨識細胞(Segmentation)，NanoLive可清楚辨識目標細胞、免疫細胞及兩者有交會的細胞，因此不需要任何螢光標記，細胞可在無光毒性的健康狀態下進行長時間的動態觀察。

有賴於高解析的成像，相較於過往實驗平台僅能評估毒殺效率；NanoLive將觀察的維度大幅的提前了！一共可分成五個階段：

FIND：

評估T cell需要花多少時間可以找到目標細胞，傳統標靶治療便是標榜可以高效找到目標進行打擊；若T cells順利地找到目標，其移動速率會降低、與目標細胞重疊率會上升，且與目標細胞的平均最小距離會縮短，如下圖所示。

A：T cell velocity (um/s)

B：Ration of T cells in contact with target cells (%)

C：Average min distance T cell – target cell (um)

BIND：

當上述的三個數值達到穩定後，便定義進入Bind Phase，輸出數據包含T cells Binding Time。

延伸範例：

1. 有效率在工作的T cells會找到一個目標細胞持續攻擊，而持續在移動地則是瞎忙的T cells喔。https://twitter.com/NanoLiveLtd/status/1483821695186132997

2. Bispecific antibodies可以同時結合兩個不同的特定目標，有機會成為幫助免疫細胞治療的一大利器；透過Live T cell assay實測，細胞間的距離下降了29%！(下圖左)

STRESS：

當目標細胞持續受到攻擊時不會立刻死亡，而是跟人一樣，會先變的不健康；而這個轉變的過程可藉由獨特的參數granularity來量化(上圖右)。此參數反應了細胞內結構的複雜度(類似流式細胞儀的SSC)，此數值若產生變化，就表示細胞受到壓力，若無法逆轉就會步入死亡。

KILL：

細胞是否死亡是由許多參數的變化共同做判斷，軟體分析會包含多個參數：

• Cell number, confluency：細胞數量和覆蓋率，當細胞死亡時數值會下降。

• Area, perimeter：細胞死亡開始縮小，面積與週長都會變小。

• Compactness, extent, circularity, eccentricity：細胞型態相關的參數，依序分別為形狀的不規則度、延伸度、圓形與橢圓的形狀程度，當細胞死亡時數值會朝偏圓的趨勢走。

• Granularity, total dry mass, mean dry mass(pg), mean dry mass density(pg/um³)：此為折射率相關的參數，是細胞斷層掃描分析儀的獨特參數；Granularity反應早期細胞壓力，細胞死亡時此數值早已下降；total dry mass反應整個視野的總折射率，mean dry mass反應細胞的平均折射率；mean dry mass density為最適合反應細胞死亡的參數，細胞死亡時雖然面積變小，但細胞質會變得濃縮致密，所以單位體積的折射率就會隨著細胞死亡而大幅上升。

上圖為3*3的拼接畫面(A)，取其中一個視野進行分析，從細胞畫面可看到有細胞已經變圓(B)，細胞覆蓋率隨著時間開始下降(C)，面積也隨著時間下降(D)，每單位體積的細胞折射率則大幅上升(E)。

上圖為毒殺細胞藥物濃度於1/500 和1/1000的定量數據，可觀察到Average(mean) cell dry mass density於定量數據呈現出高度的區別性。

Serial KILL：

實驗完成後，軟體可進一步輸出許多統計數據，協助研究人員綜觀的理解趨勢與發生變化的時間點，參數如下：

• Binding to killing interval：免疫細胞抓到目標細胞後，花多少時間殺死目標。

• Phase of target cell killing acceleration：毒殺目標細胞效率上升的持續時間。

• T cell anti-proliferative action：毒殺目標細胞的效率超越目標細胞增生效率的時間點。

• Fastest killing detection：毒殺效率最高的時間點。

• Phase of target cell killing deceleration：毒殺目標細胞效率下降的持續時間。

• Average dead target cells per hour：每小時平均殺死幾顆目標細胞。

• Total target cells killed：總共殺死多少細胞(%)。

(此為概念圖，實驗結束後輸出可得到相關時間數據，但不會自動產生此圖。)

發現新知的樂趣

活細胞斷層掃描分析儀，提供您獨一無二的影像，進一步提供您獨一無二的研究數據；除了影像與數據之外，還有機會挖掘不為人知的細節。

2022年發表於nature nanotechnology的文獻「Intercellular nanotubes mediate mitochondrial trafficking between cancer and immune cells」

癌細胞藉由nanotube與免疫細胞產生連結的畫面。
左圖為發表文獻使用電子顯微鏡拍攝，右圖為活細胞斷層掃描分析儀拍攝。
右圖影片請見連結：https://twitter.com/NanoLiveLtd/status/1463887068434735110

此文獻發現免疫細胞在毒殺癌細胞的過程中，有機會被癌細胞反過來搶劫！癌細胞會藉由nanotubes來搶劫免疫細胞的粒線體，相當於直接搶對方的能量來源。雖然此文獻並無使用活細胞斷層掃描分析儀，但活細胞斷層掃描分析儀對於未來類似現象的觀察將有極大的幫助；相信仍有許多未知的現象等著我們去研究發現，藉由全球獨一無二的影像平台，來發現屬於你的獨一無二吧。

範例研究與相關影片介紹:https://vimeo.com/604699368

最直觀的Live T cell assay介紹，想要與朋友分享就給他這個連結吧~
https://vimeo.com/618707603

Live T cell assay於不同階段的定量數據呈現。

• Case 1：Investigating the impacts of bispecific antibodies on T cells

• https://vimeo.com/601686472/9ee06d5267

• Case 2：Investigating the impacts of bispecific antibodies on T cells

• https://vimeo.com/601689146/41ef928cb4

更多資訊請見官網

https://www.nanolive.ch/products/live-cell-analytics/live-t-cell-assay/

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