醫學研究部基因定序暨生化核心團隊

原理介紹

Invitrogen total exosome isolation System 是利用聚乙二醇(PEG)從樣本中純化出外泌體(Extracellular vesicles)，早期用於收集病毒之用途。聚乙二醇(PEG)為一種高分子聚合物，與游離水分子競爭後，可降低外泌體的溶解性，再藉由低速離心方式分離出低溶解性之小分子與外泌體，因此獲得超純化之外泌體或分離外泌體的潛在亞群。

外泌體分離流程

Invitrogen total exosome isolation System針對完整的外泌體可達到高效沉降和高回收率(圖1)。無需額外且耗時的超高速離心，一般只需要15–20分鐘的操作時間。

圖1：Invitrogen total exosome isolation System流程圖 (圖片來源：Thermofisher-Exosome poster ISEV 2013 Boston)

利用此系統分離出來的外泌體經由粒徑分析 (圖2)、Western (圖3&4)及qPCR (圖5)實驗都可以得到驗證。另外，可搭配使用Dynabeads磁性分離技術以常見的外泌體表面蛋白(CD9、CD63和CD81)作為標的，可輕鬆地分離特定亞群的外泌體。

圖2: 分析 HeLa 培養基中所獲得的外泌體。(A)使用總外泌體分離試劑(取自細胞培養基)回收並分析外泌體的產量及粒徑與(B)使用傳統超高速離心法及sucrose梯度回收的外泌體。使用 NanoSight LM10 儀器分析得出的曲線顯示所有顆粒的粒徑小於300 nm，其中大部分在50–150 nm左右。

圖3: 在外泌體製備中分析CD81和CD9 標誌物。使用超高速離心法從SW480細胞培養基中富集外泌體，再利用免疫親和力的Dynabeads磁性分離法，從15 μl預富集樣品中(第1-3 lanes)進一步純化(A)CD81-陽性或(B) CD9-陽性的外泌體。分離後的亞群外泌體利用Western Blot分析 CD81和CD9抗體。M：分子量標誌物。C：未經進一步抗體純化的 7.5 μl預富集外泌體作為對照。

圖4：藉由Western blot實驗來比較超高速離心法與Total Exosome Isolation系統之外泌體CD63蛋白表現(樣本為cell medium)

圖5：進一步利用qRT-PCR實驗分析此兩種方法的外泌體miRNA表現量，從cell medium純化外泌體後抽取出RNA,利用TaqMan系統測定MicroRNAs hsa-let7e 和 hsa-miR26a 兩者表現差異。

Invitrogen total exosome isolation System優點

1. 已建立之完整protocol降低外泌體純化門檻。

2. 快速的操作時間。

3. 避免耗時的超高速離心方式。

4. 應用樣本種類廣泛如：Urine、Cerebral spinal fluid (CSF)。

5. 可擴增的實驗流程。

結論

近幾年來，外泌體分離和表徵的標準化一直是國際細胞外囊泡協會(ISEV, International Society of Extracellular Vesicles)的一項迫切需求。市面上純化外泌體的方式有許多種，而已確定會影響pull-down的純化關鍵參數包括：洗滌過程中的混合條件比例、洗滌步驟次數、洗脫體積等等。所以根據樣本特性和實驗需求選擇最佳純化方式為最初研究重要課題之一，目前基因定序暨生化核心已開放外泌體萃取服務。本核心提供四種外泌體純化方法，依照實驗內容不同提供最適實驗服務，相關資訊也將公告於醫學研究部官網及臉書粉絲頁。

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