醫學研究部基因定序暨生化核心團隊

介紹

ExoQuick聚合物沉澱法分離原理是使用高分子量的PEG沉澱法，PEG為聚乙二醇，分子量區間為6000-30000，依照特定比例廠商獨家配方優化成ExoQuick系列產品，可與疏水性蛋白和脂質分子結合，並與其競爭游離的水分子，從而使溶解度較小的分子或外泌體(EVs)從溶液中析出，並透過低速離心後得到外泌體。不需要特殊的超高速離心儀器設備，即可從血液如血清、血漿樣品中得到外泌體。若需移除背景的雜蛋白(Immunoglobulin或Albumin)，建議搭配ULTRA column，可有效去除70%的背景訊號。

聚合物程電法簡易操作流程

1. 依照樣品的不同(Culture media, Serum, Plasma, Urine)選用合適的比例之ExoQuick PEG buffer加入樣本中。

2. 於4℃作用30分鐘(依照樣本特性作用時間也不同)。

3. 低速離心3000xg，10分鐘。

4. 去除上清液體後，再次低速離心1000xg，30秒。

5. 去除上清液體，底下pellet即可收集到乾淨的EVs。

　

ExoQuick聚合物沉澱方法優點

1. 快速且不需要超高速離心。

2. 省時間與勞力。

3. 善加利用珍貴樣本。

4. 回溶EVs只需使用無菌DPBS，不需其他特殊試劑。

聚合物沉澱方法研究應用：

• Biomarker studie

• Exosomal miRNA profiling

• Exosomal proteomics

• Exosomal lipidomics/metabolomics

• Functional studies, such as in cell-to-cell signaling

• Basic biology, such as role in tumorigenesis

驗證外泌體純度之方法

當純化完畢後需使用以下3種實驗方式來確認收集到的是否為EVs

1.外泌體形態確認

TEM(穿透式電子顯微鏡Transmission Electron Microscope)確認外觀、構型。

　

2.外泌體表面蛋白質確認

可使用辨識EVs專有蛋白之抗體，例如：Transmembrane/lipid-bound protein (CD9,CD63,CD81)及Cytosolic protein (ALIX,TSG101)，搭配Western blot或Flow cytometry(流式細胞儀)做分析。

　

3.外泌體大小確認

NTA(奈米粒子追蹤分析Nanoparticle Tracking Analysis)分析size大小、濃度，ExoQuick聚合物沉澱方法回收EVs大小範圍大約為50-200nm(如下圖NanoSight分析)。

　

Cells from a human HT1080 lung sarcoma cell line were cultured in conditioned media (serum-free) for 72 hours.(資料來源：https://www.systembio.com/exoquick-tc)

Reference：

1. A comparative study of extracellular vesicle-associated and cell-free DNA and RNA for HPV detection in oropharyngeal squamous cell carcinoma (Bella Nguyen, Scientific Reports | (2020) 10:6083)

2. Plasma neuronal exosomes serve as biomarkers of cognitive impairment in HIV infection and Alzheimer’s disease (Lynn Pulliam, Journal of NeuroVirology volume 25, pages702–709 (2019)

3. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells ameliorate IL-6-induced acute liver injury through miR-455-3p (Mingyang Shao, Stem Cell Research & Therapy volume 11, Article number: 37 (2020))

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